北化梁浩课题组ACS Catalysis：理性构筑蛋白体内外自环化提升酶的催化活性和耐热性-CBG资讯-科易网技术创新

北化梁浩课题组ACS Catalysis：理性构筑蛋白体内外自环化提升酶的催化活性和耐热性

化学技术生物技术

CBG资讯 2024-04-11 364

导语

天然酶是自然进化出的优良催化剂，可以催化从简单到高度复杂的生物反应。然而，多数酶分子是脆弱的，在许多需要较高温度的工业催化中表现出较差的适应性和催化活性。因此，开发具有高耐热性的工业酶具有重要的应用价值。当前，研究工作主要从耐热宿主的基因组中挖掘高耐热性酶。然而，耐热酶筛选往往低效且昂贵。随着重组酶技术和蛋白质工程的快速发展，定点突变使人工改造获得具有更高耐热性的酶成为可能。考虑到活性与稳定性权衡（Trade-off）以及大量的迭代实验，急需开发无需大量的结构基础或复杂实验筛选的通用策略应用于酶的耐热性改造。

蛋白环化已被证明可以用来提升酶的稳定性，然而目前报道的构建环化蛋白的方式基本都没有考虑融合蛋白各元件的空间位置对环化酶结构和功能的影响，这在融合蛋白的设计时是至关重要的。基本都是在目标蛋白的N端修饰较大的寡肽SpyCatcher，C端修饰小寡肽SpyTag。由于融合蛋白各元件的位置被认为是融合蛋白序列设计中的一个重要步骤。因此，深入的结构分析有助于帮助理性设计基于异肽键的蛋白质环化反应，以更好地提高酶的耐热性和催化活性。

近期，北京化工大学生命学院梁浩教授课题组实现了一种基于结构分析的融合蛋白理性设计策略，首次提出N端修饰SpyCatcher会显著影响蛋白的活性和稳定性。该研究发现了优先翻译SpyCatcher或SpyTag都可以通过异肽键形成单一而稳定的分子内自环化。进一步通过三维结构分析发现，优先翻译SpyCatcher得到的环化酶（CBT）显著影响了酶催化口袋的结构和催化残基的取向，导致催化活性降低。此外，还发现环化酶CBT中N/C末端的距离不利于稳定环化的形成。相比之下，优先翻译较小的SpyTag时，其耐热性明显优于CBT和野生酶。因此，该研究表明自环化单元的基因融合顺序是调节环化酶催化活性和稳定性的关键因素。这一研究解决了自发分子内自环化理性设计理论的不足，为耐热性较差的工业酶的理性设计和改造提供了一种简单有效的策略。相关研究成果以封面文章发表在ACS Catalysis（DOI: 10.1021/acscatal.4c00056）。

前沿科研成果

理性设计蛋白体内外自发自环化以提升酶的耐热性和催化活性

图1. 环化酶的构建与验证（图片来源：ACS Catalysis）

作者首先以β-葡萄糖苷酶（B0）为模型酶，分别在N端或C端修饰SpyTag/SpyCatcher来构建具有不同翻译序列的自发环化蛋白（称为CBT和TBC）。通过SDS-PAGE观察到野生酶的条带位置与理论分子量一致。环化酶CBT和TBC的条带位于约120 kDa，远高于理论分子量（84.45 kDa），这一现象证实了环化的形成。而且不论在融合蛋白的N末端修饰SpyTag或SpyCatcher都不会影响环化。接下来为了探究环化对耐热性的影响，作者通过测定热孵育前后酶活性的变化计算了线性酶和环化酶的温度半衰期。CBT在30°C和40°C下的温度半衰期分别为92.28 min和62.07 min，显著优于B0（17.61 min，10.84 min；图2）。且TBC耐热性的改善更加明显。在30°C和40°C时，TBC的温度半衰期分别是B0的8.58倍和10.83倍。

图2. 环化酶和线性酶在30°C（A）和40°C（B）下的温度半衰期（图片来源：ACS Catalysis）

为了探究基因融合位置对自环化和酶结构的影响，作者通过分子动力学模拟研究了两种环化酶的三维结构。基于AlphaFold2从头预测构建了野生酶和融合蛋白CBT，TBC的三维结构，利用拉伸分子动力学（SMD）得到环化酶的模型。由于折叠时空间位阻的存在，修饰在环化酶N端的短寡肽SpyTag或长寡肽SpyCatcher折叠后会定位在不同的空间位置，处于不利的空间位置下形成的环化酶耐热性提升略低，但是这并不会影响稳定的自环化的形成。

图3. 环化酶和线性酶的三维结构（图片来源：ACS Catalysis）

通过比较B0和TBC的结构作者发现，当融合蛋白优先翻译较小的SpyTag时，催化口袋的构象与野生型酶几乎相同。相比之下，CBT催化口袋的loop区和催化三联体（Asp/Asp/His）的朝向与B0有显著差异，导致CBT的活性低于TBC。因此作者认为，优先翻译较小的SpyTag有助于精准折叠融合蛋白，实现具有更优异构象的自环化。

图4. 环化酶和线性酶结构对比（图片来源：ACS Catalysis）

为了验证本研究中设计的环化葡萄糖苷酶的工业应用前景，作者还使用B0和TBC水解人参皂苷Rg1制备了稀有人参皂苷F1。TBC在24 h内将Rg1全部转化为F1，收率为0.269 g/L。相比之下，B0在15 h内仅得到0.169 g/L的F1，且18 h后产量不再增加。为了检验优先翻译的长寡肽SpyCatcher影响环化酶的活性和稳定性的结论的普遍性，作者还使用SpyCatcher/SpyTag的自发异肽键构建了自环化SPase。两种环化酶（CST和TSC）同样都可以形成稳定自环化并在高温下表现出比野生酶更好的催化性能。45°C反应24 h后，甘油葡萄糖苷收率分别达到219.92 g/L和242.29 g/L，而野生酶只有166.11 g/L。

图5. 环化葡萄糖苷酶和蔗糖磷酸化酶制备高价值化合物人参皂苷F1和甘油葡萄糖苷（图片来源：ACS Catalysis）

最后，作者以全细胞催化剂的形式使用体内环化酶制备了人参皂苷F1。B0细菌24小时F1产量为0.18 g/L，随后不再增加。而TBC细菌36 h内F1产量0.292 g/L，Rg1转化率91.4%。与此同时，细菌在长时间储存时表现更好。在室温下储存10天后B0细菌失去了74%的催化活性，TBC细菌还保持着高于50%的催化活性。

图6. 环化葡萄糖苷酶作为全细胞催化剂的应用（图片来源：ACS Catalysis）

综上所述，本工作提供了一种基于结构分析的融合蛋白理性设计策略，以获得具有更优异性能的环化酶。优先翻译SpyCatcher或SpyTag的两种融合蛋白都可以通过异肽键形成单一且稳定的分子内自环化。但是，通过三维结构分析发现，优先翻译空间位阻大的单元会导致SpyCatcher和SpyTag之间的距离不利于耐热性的提高，且会显著影响催化口袋的结构和催化残基的取向，导致活性降低。自环化单元的基因融合顺序是调控环化酶催化活性和稳定性的关键因素。在设计融合蛋白序列时，必须考虑空间位阻较低的单元的优先翻译，以尽量减少对后续翻译和折叠的影响。

该工作以“Rational Design of Spontaneous Self-Cyclization Enzymes In Vivo and In Vitro with Improved Thermal Tolerance and Activity”为题发表在ACS Catalysis上（DOI: 10.1021/acscatal.4c00056）上。论文第一作者为北京化工大学生命科学与技术学院2022级博士研究生魏斌，通讯作者为北京化工大学生命科学与技术学院梁浩教授。

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